Importancia del pretratamiento de la muestra.
El pretratamiento de muestras es un paso que requiere mucho tiempo y es propenso a errores en el análisis instrumental (especialmente el análisis cromatográfico). La calidad del tratamiento de la muestra afecta directamente al resultado final del análisis cromatográfico. Por lo tanto, para mejorar la eficiencia del análisis y la determinación, mejorar y optimizar los métodos y técnicas de preparación de muestras para el análisis cromatográfico es una cuestión importante. Dado que algunas muestras pertenecen a sistemas matriciales complejos que contienen componentes como proteínas, aceites, carbohidratos, pigmentos, etc., el fondo complejo de la matriz causará grandes problemas para la extracción, separación, purificación y determinación de los compuestos objetivo a analizar. Por lo tanto, el pretratamiento de la muestra no sólo es complejo y difícil, sino que también tiene un papel decisivo en la precisión, fiabilidad y sensibilidad de los resultados del análisis.
Porcentaje de consumo de tiempo de pretratamiento de la muestra
Para instrumentos LC/MS/MS altamente sensibles, el pretratamiento adecuado de la muestra es crucial para reducir la interferencia de la matriz y enriquecer los componentes.
Principios del pretratamiento de muestras.
Evite cambios químicos en los componentes durante la preparación; prevenir y evitar la contaminación de componentes predeterminados; minimizar la introducción de compuestos irrelevantes en el proceso de preparación; y hacerlo lo más simple y fácil posible.
Propósito del pretratamiento de la muestra
Eliminar partículas; reducir las impurezas que interfieren; concentrar oligoelementos; mejorar la sensibilidad y selectividad de la detección; mejorar el efecto de separación; proteger columnas e instrumentos cromatográficos; reemplazo de solvente.
Tendencia de desarrollo del pretratamiento de muestras.
▶El pretratamiento de muestras común incluye: Método de digestión: un método para colocar la muestra con ácido, oxidante, catalizador, etc. en un dispositivo de reflujo o en un dispositivo cerrado, calentando y descomponiendo y destruyendo la materia orgánica. Método de digestión húmeda
1. Método de digestión con ácido nítrico (para muestras de soluciones acuosas más claras) 2. Método de digestión con ácido nítrico y ácido perclórico (digestión de muestras que contienen materia orgánica difícil de oxidar) 3. Método de digestión con ácido nítrico y ácido sulfúrico (ácido nítrico: ácido sulfúrico=5:2, a menudo añadiendo una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno) 4. Método de digestión con ácido sulfúrico y ácido fosfórico (ayuda a eliminar la interferencia de los iones Fe3+ durante la determinación) 5. Método de digestión con ácido sulfúrico y permanganato de potasio (comúnmente utilizado para determinar muestras de mercurio en solución acuosa) 6. Método de digestión con ácido nítrico y peróxido de hidrógeno: algunas personas usan este método para digerir productos biológicos para determinar nitrógeno, fósforo, potasio, boro, arsénico, flúor y otros elementos 7. Método de digestión multicomponente: Se requiere un sistema de digestión de tres o más ácidos u oxidantes. Método de ceniza seca (método de descomposición a alta temperatura)
1. El método de la ceniza no utiliza o utiliza una pequeña cantidad de reactivos químicos para descomponer las muestras y puede manejar muestras de pesaje más grandes, por lo que es beneficioso mejorar la precisión de la determinación de oligoelementos. 2. La temperatura de incineración es generalmente 450-550 grados, lo que no es adecuado para procesar muestras con componentes volátiles, y el tiempo de incineración también es relativamente largo. 3. Según el tipo de muestra y las propiedades de los componentes a medir, se seleccionan diferentes crisoles y temperaturas de incineración. Los crisoles de uso común son cuarzo, platino, plata, níquel, hierro, porcelana, politetrafluoroetileno y otras propiedades. El principio es que el crisol no reacciona con la muestra y es estable a la temperatura de procesamiento. 4. Por lo general, no se agregan otros reactivos a las muestras biológicas incineradas, pero para promover la descomposición e inhibir la pérdida por volatilización de ciertos elementos, a menudo se agrega una cantidad adecuada de agente incinerador auxiliar. Una vez que la muestra se ha incinerado por completo, se disuelve en ácido nítrico diluido o ácido clorhídrico para su análisis y determinación.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm) es mayor que el de HLPC (3-10μm). Por lo tanto, el SPE sólo se puede utilizar para separar compuestos con propiedades de retención muy diferentes. La tecnología SPE con baja eficiencia de separación se utiliza principalmente para procesar muestras. El propósito de SPE es eliminar de la muestra sustancias que interfieren con el análisis posterior; enriquecer los oligoelementos y mejorar la sensibilidad analítica; cambiar el disolvente de la muestra para que coincida con el método analítico; derivatización in situ; desalación de muestras; y facilitar el almacenamiento y transporte de muestras. Instalación de columna SPE: el tamaño de partícula del relleno es diferente al del relleno de columna HLPC y el resto es el mismo. La más utilizada es la fase C18. Este tipo de carga es altamente hidrófobo y muestra retención de la mayor parte de la materia orgánica en la fase acuosa; También se utilizan otros materiales con diferentes propiedades de selectividad y retención. Las fases de SPE con grupos activos o recubiertas con compuestos activos se pueden utilizar para analizar reacciones de derivatización. Disco SPE: muy similar a los filtros de membrana. El disco extractor es un disco de PTFE que contiene masilla o una lámina de fibra de vidrio cargada con masilla; el relleno representa aproximadamente del 60 % al 90 % del disco SPE total y el espesor del disco es de aproximadamente 1 mm. La diferencia con el primero es la relación espesor/diámetro del lecho (L/d). Adecuado para enriquecer trazas de contaminantes del agua. Microextracción en fase sólida (SPME) SPE fuera de línea y en línea SPE fuera de línea 1. La SPE y el análisis se realizan de forma independiente, y la SPE solo proporciona muestras adecuadas para análisis posteriores. 2. Para garantizar un contacto suficiente entre la solución de muestra y el relleno, el flujo de disolvente no puede ser demasiado alto. 3. Puede completarse mediante instrumentos automatizados. El instrumento SPE automático consta de un bastidor de columnas, una bomba de émbolo, un depósito de líquido, una tubería y un procesador de muestras. La SPE en línea también se conoce como tecnología de purificación y enriquecimiento en línea, que se utiliza principalmente para el establecimiento del método SPE de análisis HLPC Propósito del pretratamiento de la columna: 1. Eliminar las impurezas que puedan existir en el relleno; 2. Disolver el relleno y mejorar la reproducibilidad de la extracción en fase sólida. Adición de muestra 1. Para evitar la pérdida de analitos, la concentración de disolvente de la muestra no debe ser demasiado alta; 2. Cuando se extrae con mecánica de fase inversa, se utiliza agua o tampón como disolvente y la cantidad de disolvente orgánico no supera el 10% (V/V); 3. Para superar la pérdida de analitos durante la adición de la muestra, se pueden usar disolventes débiles para diluir la muestra, reducir el volumen de la muestra, aumentar la cantidad de relleno en la columna SPE y seleccionar adsorbentes que tengan una fuerte retención del analito. Elución y recolección de analitos (otro caso es que las impurezas se retienen mientras los analitos pasan a través de la columna) (Extracción en fase sólida con medios de dispersión sólidos) 1. Para columnas de extracción en fase inversa, el solvente de limpieza es agua o tampón que contiene una concentración adecuada de compuestos orgánicos. solvente; 2. Para determinar la concentración y el volumen óptimos del disolvente de limpieza, agregue la muestra a la columna SPE, límpiela con 5 a 10 veces el volumen del lecho de la columna SPE, recolecte y analice el efluente a su vez y obtenga el perfil de elución. del disolvente de limpieza del analito. Aumentar a su vez la fuerza del solvente de limpieza y determinar la fuerza y el volumen apropiados del solvente de limpieza de acuerdo con el perfil de elución del analito en diferentes fuerzas; 3. Propósito de la elución y recolección: eluir completamente el analito y recolectarlo en la fracción de volumen más pequeña, reteniendo tantas impurezas como sea posible que se retienen con más fuerza que el analito en la columna SPE; 4. Para aumentar la concentración del analito o ajustar las propiedades del solvente para análisis posteriores, la fracción del analito recolectada se puede secar con nitrógeno y luego disolverse en un pequeño volumen de solvente. Aplicación del análisis ambiental SPE 1. La concentración de analitos en muestras ambientales, como el agua superficial, es muy baja y el analito debe enriquecerse antes del análisis. 2. La composición de los fluidos biológicos es compleja y contiene una gran cantidad de proteínas. Antes del análisis, es necesario pretratar la muestra para eliminar la proteína. Análisis de fármacos Análisis clínico Análisis de alimentos y bebidas Microextracción en fase sólida (SPME) La microextracción en fase sólida integra "muestreo, extracción, concentración e inyección" y se puede utilizar junto con la cromatografía de gases o la cromatografía líquida de alto rendimiento para la tecnología de pretratamiento de muestras. Teoría de la microextracción en fase sólida Teoría del equilibrio: Durante el proceso de adsorción, se establece un equilibrio de adsorción entre la fase sólida y líquida o gaseosa. Después de un cierto período de tiempo, debido al lento proceso de transferencia de masa, el equilibrio no se alcanza por completo. La selectividad de la extracción del material de revestimiento depende principalmente del rendimiento del material de revestimiento. Según el principio de que el analito se extrae fácilmente mediante una fase sólida con polaridad similar, se selecciona un recubrimiento de SPE adecuado. Las sustancias más utilizadas para recubrimientos de fase sólida son el polimetilsiloxano (PDMS) y el poliacrilato (PA), los cuales pueden usarse para cromatografía de gases y cromatografía líquida. El primero se usa principalmente para compuestos no polares como compuestos volátiles, hidrocarburos aromáticos policíclicos e hidrocarburos aromáticos, y el segundo se usa principalmente para compuestos polares como triazinas y compuestos fenólicos. La capa de fase sólida puede recubrirse sobre la fibra de cuarzo en forma no unida, unida o parcialmente reticulada. Agregar algunos polímeros al recubrimiento puede aumentar la superficie del recubrimiento y mejorar la eficiencia del SPME. 1. Polidimetilsiloxano-divinilbenceno (PDMS-DVB), utilizado para hidrocarburos aromáticos y compuestos volátiles. 2. Polietilenglicol-divinilbenceno (CW-DVB), utilizado para compuestos polares como los alcoholes. 3. Resina de plantilla de polietilenglicol (CW-TPR), utilizada para tensioactivos ionizados. 4. Fibra de cuarzo recubierta con negro de humo de grafito, utilizada para analizar trazas de contaminantes en el agua y el aire. 5. Establecimiento de métodos de nanotubos de carbono y nanotubos de dióxido de titanio 1. Mantener la coherencia de las condiciones de muestreo. 2. Los factores que afectan el muestreo incluyen el tiempo de muestreo, la temperatura, la profundidad de la fibra, etc. 3. Mantener una relación lineal entre el valor de respuesta y la concentración inicial del analito. La concentración de la muestra no puede ser demasiado alta y el volumen de la muestra no puede ser demasiado pequeño, de modo que la extracción esté dentro del rango lineal de la isoterma de adsorción. 4. Agregar electrolitos a la muestra puede aumentar la fuerza iónica de la solución, reduciendo así la solubilidad del analito y mejorando la eficiencia de extracción; cambiar el pH de la muestra tiene un mayor efecto en la tasa de extracción de sustancias ácidas y alcalinas. Nota: El efecto de agregar sal en la microextracción a veces es diferente al de la extracción líquido-líquido convencional y es necesario optimizar las condiciones experimentales. 5. Agitar puede acortar el tiempo de extracción. Extracción por microondas (MAE) La extracción por microondas tiene un tiempo de extracción corto, buena selectividad, alta tasa de recuperación, bajo uso de reactivos, baja contaminación, puede usar agua como extractante y puede controlar automáticamente las condiciones de preparación de la muestra; tiene menos aplicaciones y actualmente se utiliza en la extracción de hidrocarburos aromáticos policíclicos, residuos de pesticidas, compuestos organometálicos, ingredientes activos en plantas, sustancias nocivas, metales en minerales, fármacos en sangre y residuos de pesticidas en muestras biológicas. Principios y características de los métodos de extracción por microondas Absorber microondas (agua, etanol, ácido, álcali y sales) Alta eficiencia de extracción por microondas: 1. Acción directa de las microondas sobre las sustancias separadas; 2. Es más ventajoso utilizar disolventes polares que no polares para la extracción por microondas; 3. El uso de recipientes cerrados permite realizar la extracción por microondas a una temperatura muy superior al punto de ebullición del disolvente, mejorando significativamente la eficiencia de la extracción por microondas Refleja microondas (sustancias metálicas) Transmite microondas (sustancias no polares) Extracción por microondas Equipos y métodos (los componentes principales son dispositivos de calentamiento por microondas, recipientes de extracción y dispositivos de control de presión y temperatura especialmente fabricados, equipados según diferentes requisitos). Multicavidad 2450 MHz: se pueden preparar varias muestras a la vez, es fácil controlar las condiciones de extracción. , y el la extracción es rápida. Método de extracción por microondas convencional: mezcle solventes polares o una mezcla de solventes polares y solventes no polares con las muestras extraídas, colóquelas en recipientes de preparación de muestras de microondas y caliéntelas en un sistema de preparación de muestras de microondas en estado cerrado. Controlar la presión o temperatura de extracción y el tiempo según los requerimientos de los componentes extraídos; al final del calentamiento, se filtra la muestra y el filtrado se mide directamente o se mide después del tratamiento correspondiente. En circunstancias normales, el tiempo de calentamiento de extracción por microondas es de aproximadamente 5 a 10 minutos. El volumen total del disolvente de extracción y la muestra no deberá exceder 1/3 del volumen del vaso de preparación de muestras. Enfoque monomodo de 2450 MHz: no se requiere control de presión ni temperatura, el volumen de preparación de la muestra es grande, solo se puede preparar una muestra a la vez y el tiempo de extracción es largo. Extracción de fluidos supercríticos (SCF)
El fluido supercrítico (SCF) es un fluido cuya temperatura y presión son superiores al punto crítico. Sus características propias son: 1. Su coeficiente de difusión es menor que el del gas, pero un orden de magnitud mayor que el del líquido; 2. Su viscosidad es cercana a la del gas; 3. Su densidad es similar a la del líquido y un ligero cambio de presión puede provocar un cambio significativo en su densidad; 4. Los cambios de presión o temperatura pueden provocar cambios de fase. Principio básico En el estado supercrítico, el fluido supercrítico se pone en contacto con la sustancia a separar, de modo que pueda extraer selectivamente los componentes de polaridad, punto de ebullición y masa molecular relativa a su vez, y la densidad y la constante dieléctrica del fluido supercrítico aumentan. con el aumento de la presión del sistema cerrado, y la polaridad aumenta. Los componentes de diferentes polaridades se pueden extraer paso a paso utilizando el programa Boost. La solubilidad del CO2 supercrítico: 1. Los componentes lipófilos y de bajo punto de ebullición se pueden extraer a baja presión (104 kPa); 2. Cuantos más grupos polares tenga un compuesto, más difícil será extraerlo; 3. Cuanto mayor sea la masa molecular relativa del compuesto, más difícil será extraerlo. El modificador CO2 es un disolvente no polar y, generalmente, se añade un disolvente polar para mejorar su solubilidad en CO2, por lo que se denomina modificador. Los más utilizados son metanol, acetona, etanol, acetato de etilo, etc. El efecto del modificador es limitado. Si bien cambia la solubilidad del fluido supercrítico, también debilitará el efecto de captura del sistema de extracción, lo que dará como resultado un aumento de los coextractos, lo que puede interferir con la determinación analítica. La cantidad de modificador utilizada debe ser pequeña y generalmente no exceder el 5%. La aplicación de la tecnología de extracción con fluidos supercríticos tiene grandes ventajas en la extracción de sustancias naturales; se puede utilizar junto con GC, IR, MS, LC, etc. para convertirse en un método analítico eficiente.
